Нобелевская премия по физиологии и медицине — 2017
Нобелевская премия 2017 года вручена за открытие и исследование молекулярных механизмов, управляющих циркадными ритмами — внутренними часами, которые работают в живых организмах, подстраивая жизнедеятельность к смене дня и ночи. Подавляющая часть физиологических процессов связана с циркадными ритмами. Лауреатами стали трое американских ученых — Джеффри Холл, Майкл Росбаш и Майкл Янг. В работах их научных групп, которые продолжались не одно десятилетие с 1970-х годов, практически на пустом месте была создана новая наука, ставшая надежной базой для дальнейших исследований.
В 2017 году Нобелевскую премию по физиологии и медицине получили трое американских ученых, Джеффри Холл (Jeffrey C. Hall), Майкл Росбаш (Michael Rosbash) и Майкл Янг (Michael W. Young), сформировавшие наш современный взгляд на циркадные ритмы, раскрывшие их природу и чуть-чуть — механизмы их работы. Циркадные ритмы — это внутренние часы, которые работают у любого живого организма, подстраивая его жизнедеятельность к смене дня и ночи. Однажды мне самой пришлось убедиться в их эффективности. Так случилось, что, отправившись летом в двухнедельный поход по северу России, и я, и мой товарищ забыли часы. Стояли белые ночи, так что определить время привычным способом было невозможно, все время светило солнце. Оставалось надеяться на свои внутренние часы, которые, как правило, настроены на суточный цикл. И действительно, за две недели они «отстали» всего на два-три часа, так что к отправлению поезда мы попали вовремя. Так или иначе, у всех живых организмов внутренние часы регулируют физиологические циклы отдыха и бодрствования, температуры, мышечной активности у животных, внимания и т. д.
Холл, Росбаш и Янг начали свои эпохальные работы в начале 70-х, и, чтобы понять значение их открытий, нужно вернуться назад, в конец 60-х, и посмотреть, что интересовало специалистов по суточным ритмам в то время, когда стартовали исследования теперешних Нобелевских лауреатов. В 1729 году французский астроном Жан-Жак де Меран наблюдал суточные изменения у мимозы: оставленная в темноте, она закрывала и разворачивала листья вне зависимости от освещенности, в соответствии со своими внутренними настройками на 24-часовой ритм. С этого началась наука о суточных или циркадных ритмах (от лат. circa — круг, dies — день). Через два с половиной столетия, в 1960 году на симпозиуме в Колд Спринг Харбор с говорящим наименованием «Суточные ритмы» были суммированы достижения в этой области и главные текущие вопросы (см. Jürgen Aschoff, 1960. Exogenous and Endogenous Components in Circadian Rhythms): «Мы так ничего и не знаем о типах суточных часов. Открытым остается вопрос о том, идут ли эти часы постоянно или начинают идти и останавливаются после прохождения 24-часового цикла, а затем их требуется «завести» снова. Употребляя термин «часы», мы не предполагаем, что циферблат обязан состоять из 24 делений. Часы должны измерять время, и разные организмы измеряют тот период времени, который подходит для их целей. <…> Можно ожидать, что внутри того или иного организма работают несколько часов с совершенно разными циферблатами. И они не обязаны идти постоянно, а могут заводиться лишь в определенный жизненный момент. <…> В настоящее время циркадные ритмы изучаются с помощью измерений различных функций организмов. Но никто не может с надежностью утверждать, как наблюдаемые изменения связаны с внутренними часами, и, соответственно, какая из функций наилучшим образом представляет эти часы. <…> Было бы исключительно полезно, если бы мы смогли показать, что, какую бы функцию мы ни взяли — эозинофилы, или локомоцию или еще что-нибудь, — результаты циркадных экспериментов будут всегда сходными…»
Как видно, о природе циркадных ритмов к 1970-м годам толком ничего не было известно, и было даже не слишком ясно, с какой стороны к этому вопросу подступиться. В начале 1970-х Сеймур Бензер (Seymour Benzer) и Рональд Конопка (Ronald J. Konopka) запустили исследования на дрозофилах, выявив один ген, — они его назвали period (per), — связанный с циркадными ритмами. Он находился на Х-хромосоме: его удалось картировать, ограничив его с обеих сторон известными мутациями.
Ген per был первым выявленным материальным носителем внутренних суточных ритмов: нечто, присущее исключительно организму, а не среде, связано с цикличностью физиологических проявлений. Мутации в этом гене нарушали циркадную ритмику и у личинок, и у взрослых, так что это был ген, который контролировал суточную физиологию на всех стадиях развития, — ген общего действия, регулятор высокого уровня. Поэтому вокруг локуса per развернулась активная работа, в которую включились Джеффри Холл и Майкл Росбаш.
С использованием передовой тогда технологии клонирования участков ДНК в бактериях, они смогли напрямую доказать связь period с циркадными ритмами. Вместе с Рональдом Конопкой и коллегами из Массачусетского и Нью-Йоркского университетов они сначала с большей точностью изучили строение самого локуса, выделили его функциональную часть, клонировали ее в бактериях, а затем с помощью плазмидных векторов интродуцировали нормальные участки в мух, мутантных по гену per (W. A. Zehring et al., 1984. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster). Сегодня такая работа представляется хоть и кропотливой, но вполне рутинной, а в начале 80-х это был самый передовой край науки. В результате у мутантных мух с апериодичной двигательной активностью и другими нарушениями цикличности (в частности, в самцовой песенке ухаживания) суточные ритмы восстановились. Тогда же они определили несколько транскриптов с этого локуса и нашли один с интересными свойствами. Во-первых, он у мутантов или отсутствовал, или присутствовал в ничтожном количестве, во-вторых, у нормальных мух его количество резко менялось в течение дня: днем его было много, а ночью мало (P. Reddy et al., 1984. Molecular analysis of the period locus in Drosophila melanogaster and identification of a transcript involved in biological rhythms). Очевидно, что белковый продукт, снятый с этой интересной мРНК, напрямую участвует в регуляции суточного ритма. Иными словами, это кандидат на роль главного ритмоводителя физиологических часов. Они идут постоянно и не требуют ежедневного завода.
Параллельно ту же самую работу с тем же самым результатом в Рокфеллеровском университете Нью-Йорка проделала команда Майкла Янга, опубликовав результаты ровно тогда же, в 1984 году (T. A. Bargiello et al., 1984. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila). Ясно, что этой работе предшествовали столь же аккуратные исследования строения локуса per и его транскриптов, выполненные Янгом с коллегами.
Одна команда продемонстрировала, что per экспрессируется практически во всех тканях тела (J. C. Hall, M. Rosbash, 1987. Genetic and molecular analysis of biological rhythms), в особенности в глазах и в мозге, а другая команда (M. K. Baylies et al., 1987. Changes in abundance or structure of the per gene product can alter periodicity of the Drosophila clock) установила, что длительность цикла зависит от количества продуктов per. И то, и другое вплотную придвинуло исследователей к вопросу о механизме регуляции суточных ритмов.
И действительно, вскоре Холлом и Росбашом (P. E. Hardin et al., 1990. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels) была предложена принципиальная модель регуляции суточных ритмов. Она основывалась на идее обратной связи между белком PER и интенсивностью экспрессии соответствующего гена: накопление белка тормозит его синтез, а при снижении количества белка синтез активируется. В этой модели, помимо принципиальной схемы, были поставлены вопросы (буквально): за счет каких молекулярных механизмов срабатывает эта петля? какие есть белковые и генетические инструменты для реализации этой схемы? как влияет поведение на суточные ритмы? где происходит молекулярная регуляция — в ядре (экспрессия per) или цитоплазме (активность мРНК)? Иными словами, была составлена программа будущих исследований.
Занявшись иммуноцитохимическими опытами, Росбаш и Холл в 1992 году определили, где внутри клетки концентрируется белок PER (X. Liu et al., 1992. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila). Оказалось, что внутри ядра. Ученые заключили, что PER выступает транскрипционным фактором, который регулирует собственный ген per. Как этот белок попадает в ядро, ведь синтезируется он в цитоплазме?
На этот вопрос смог ответить Янг, который к этому времени решил поискать другие гены, влияющие на суточные ритмы активности дрозофил. Для этого он с коллегами проанализировал около 7000 мутаций, выявив одну, которая удовлетворяла требованиям периодичности (A. Sehgal et al., 1994. Loss of circadian behavioral rhythms and per RNA oscillations in the Drosophila mutant timeless). Эта мутация была названа timeless (с белком TIM). У мутантов по этому гену суточные ритмы нарушались. В серии экспериментов команде Янга удалось показать, что period и timeless работают в связке, и именно новооткрытый белок TIM обеспечивает доставку PER в ядро. Там они блокируют транскрипционные факторы, запускающие их собственный синтез. У мутантов perl с удлиненным ритмом измененный белок PER хуже связывается с TIM, и, вероятно, из-за этого задерживается доставка и аккумуляция тормозящей связки PER/TIM в ядро. Позже было также доказано, что количество TIM в клетке меняется в зависимости от освещенности. Таким образом, жизненный ритм организма подстраивается к смене дня и ночи.
Через некоторое время Янг выявил и исследовал еще один ген, участвующий в регуляции суточных ритмов. Для этого понадобилось прочитать 15 000 хромосом (были выбраны вторая и третья хромосомы) у мух, которых подвергли действию химического мутагена. В результате были выделены две линии с новой мутацией в гене doubletime (dbt) с соответствующим белком. Одна из них — первая из обнаруженных — резко укорачивала период ритмов (отсюда и название гена — вместо 24-часового получался 18-часовой цикл активности). А другая, наоборот, увеличивала период циклов до 26–27 часов.
Роль этого гена (точнее, его белка), как выяснилось, состоит в том, чтобы разрушать избыточные PER (за счет фосфорилирования), которые накапливаются в цитоплазме. Когда в цитоплазму поступают TIM, то они связываются с PER и переправляются в ядро, остаток PER должен быть удален из цитоплазмы для начала следующего цикла. Это и делают DBT. И если при постоянном освещении или его отсутствии цикличность поступления TIM в цитоплазму нарушается, то DBT способны сами собой поддерживать цикл без всякой смены освещенности. Именно поэтому у мутантов dbt регистрируются нарушения суточных циклов лишь в экспериментах в темноте, а при нормальной смене светлой и темной фазы суточная ритмика у них не нарушается — срабатывает регуляция TIM. Так что DBT обеспечивает стабильность суточных ритмов при сбоях темной и светлой фаз.
Таким образом, приступив в 70-х годах к исследованиям в дисциплине, которая состояла из одних вопросов, к началу нового века эти трое ученых, ставшие лауреатами Нобелевской премии в этом году, фактически заново создали науку о циркадных ритмах. Они построили предметную базу для очень полезных и академических, и прикладных исследований. Ведь подавляющая часть физиологических процессов живых организмов завязана на суточных ритмах, и каждая собственным биохимическим способом с ними соотносится.
Елена Наймарк