Человеческий мозг такой большой благодаря генам семейства Notch2NL

Сразу два коллектива ученых опубликовали статьи с результатами своих исследований генетических механизмов работы мозга. Было обнаружено, что вся история начинается с дупликации гена Notch2, кодирующего важнейший мембранный белок-рецептор, играющий роль в передаче сигналов между соседними клетками и в регуляции процессов деления/дифференцировки нейронов в мозге эмбриона. Дупликация первоначально произошла у общего предка человека, гориллы и шимпанзе, но на этом этапе копия фрагмента гена Notch2 (обозначаемая Notch2NL) оказалась нефункциональной. Однако около трех миллионов лет назад в линии австралопитеков генная конверсия привела к восстановлению рамки считывания, а на протяжении последующей истории эволюции рода Homo произошло еще три дупликации новообразованного гена. Так образовалось семейство генов Notch2NL. Эти гены кодируют белки, очень похожие на Notch2, но секретируемые, а не встроенные в мембрану рецепторы. Работая в тканях растущего мозга, они повышают интенсивность клеточных делений клеток-предшественников нейронов и формирование более крупного мозга с более развитой корой. Выводы ученых подкрепляются давно установленной ролью мутаций типа делеций/дупликаций соответствующего участка хромосомы в развитии макроцефалии и микроцефалии у людей.

Недавно в журнале Cell одновременно были опубликованы два исследования, посвященные новооткрытым генам, сыгравшим, по-видимому, существенную роль в эволюции размера человеческого мозга. Статья большой группы ученых из преимущественно американских научных учреждений во главе с Иэном Фиддесом (Ian T. Fiddes) называется Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Статья их коллег из Брюссельского свободного университета во главе с Икуо Судзуки (Ikuo K. Suzuki) называется Human-Specific NOTCH2NL Genes Expand Cortical Neurogenesis through Delta/Notch Regulation. Но прежде, чем начать рассказ о новых открытиях, нужно разобраться в двух общебиологических феноменах, имеющих прямое отношение к делу.

Первый — формирование коры головного мозга в ходе эмбрионального развития. Головной мозг образуется как расширение на переднем конце нервной трубки, у человека его формирование начинается на 3–4 неделе развития эмбриона (основные этапы развития центральной нервной системы человека хорошо показаны в этом видео). И уже на самом раннем этапе начинает формироваться будущая кора головного мозга. Схема этого процесса показана на рис. 2. Наиболее недифференцированные нейрогенные клетки располагаются в самом глубоком слое — вентрикулярной зоне (ventricular zone). Отсюда клетки перемещаются в субвентрикулярную зону (subventricular zone), где происходит их активное размножение. По мере дальнейшего продвижения в промежуточную зону и, наконец, кортикальную пластинку клетки-предшественники дифференцируются в зрелые нейроны. В коре взрослого человека шесть слоев зрелых нейронов, со специальными свойствами и функциями, но на отображенных этапах эмбрионального развития присутствуют лишь некоторые из них — на рис. 2 эти слои подписаны цифрами.

Второй феномен — что собой представляет сигнальный каскад Notch-рецепторов, и каким образом он помогает определить судьбу клеток в развивающемся мозге эмбриона. Схема и пояснения на рис. 3. В этой системе есть два ключевых игрока: собственно, рецептор Notch и его лиганд (белок, специфично взаимодействующий с белком Notch). И рецептор, и лиганд представляют собой мембранные белки — это значит, что часть молекулы заякорена в мембране, часть торчит снаружи от клетки (внеклеточный домен), а еще одна часть, наоборот, обращена внутрь клетки (внутриклеточный домен). Смысл в том, что, приняв сигнал снаружи (взаимодействие с лигандом), рецептор изменяется таким образом, что сигнал передается на внутриклеточный домен, а далее каскад событий уже внутри клетки меняет ее поведение — в данном случае, направление дифференцировки (см. также видео).

Вся эта система содержит одну интересную и важную хитрость: первоначально на незрелых клетках экспрессируются в небольшом числе и рецепторы, и лиганды. Но после того, как контакт двух соседних клеток произошел, сложная система обратных связей приводит к тому, что та клетка, которая вступила в контакт молекулой-рецептором (случайно), начинает синтезировать больше молекул-рецепторов, но меньше молекул-лигандов. Та же клетка, которая вступила в контакт молекулой-лигандом (тоже случайно), — наоборот, синтезирует в дальнейшем меньше молекул-рецепторов, и больше молекул-лигандов. Так две соседние клетки, изначально одинаковые, становятся разными и принимают разные направления дифференцировки. В случае нейронов та клетка, которая преимущественно представляет рецептор, сохраняет потенциал дальнейшего деления, то есть свойства незрелой клетки, а та, которая преимущественно представляет лиганд, прекращает делиться и переходит к дифференцировке в зрелый нейрон. Нужно отметить, что система Notch-сигналинга (Notch signaling pathway) имеется у всех животных и многократно задействована в дифференцировке самых разных тканей, включая, помимо мозга, мышцы, слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, поджелудочную железу, кроветворение и пр.

Два обсуждаемых исследования замечательно дополняют друг друга. Во-первых, они подтверждают одинаковые выводы, но используют разные методические подходы, что очень повышает градус доверия к полученным результатам. Во-вторых, каждое из них выявляет какие-то стороны функционирования системы сигналинга, которые не были рассмотрены в другой работе.

Общие итоги (совпадающие в двух работах) следующие:
    1) Гены семейства Notch2NL сформировались посредством нескольких событий внутрихромосомных дупликаций. Вся цепочка событий занимает промежуток от 8–10 млн лет назад (когда жил общий предок гориллы, шимпанзе и человека) до около 0,5 млн лет назад, когда произошла последняя дупликация в линии, ведущей непосредственно к людям. Вся история показана на рис. 4. Тут сразу нужно отметить, что участок хромосомы 1q21 (именно здесь располагаются 3 из 4 членов семейства Notch2NL) давно известен как горячая точка делеций и дупликаций в популяции людей, причем эти мутации ассоциируются с патологиями развития и работы центральной нервной системы.

    2) Гены Notch2NL экспрессируются в эмбриональной коре головного мозга, там же, где и ген-предшественник рецептора Notch2. Четыре гена семейства (Notch2NLA, Notch2NLB, Notch2NLC, Notch2NLR) экспрессируются неодинаково активно, распределяясь таким образом: A > B > C > R (рис. 1).
    3) В экспериментах искусственное повышение экспрессии Notch2NL (типа А и В) в клетках приводило к увеличению числа делящихся клеток и снижению числа дифференцированных клеток. Искусственное отключение этих же генов давало противоположный результат. В частности, на рис. 5, взятом из обсуждаемой статьи «американской» группы, показаны результаты работы по манипуляции с искусственными органоидами мозга, выращенными из человеческих или мышиных эмбриональных стволовых клеток. Их коллеги из Бельгии получили аналогичный результат на колониях эмбриональных клеток в культуре, а также на полноценных мышиных эмбрионах, клетки мозга которых генетически модифицировали посредством электропорации прямо в матке мышки-мамы.

Теперь нужно сказать об индивидуальных заслугах авторов.

Анализ геномов нескольких сотен людей, который провела «американская» группа, показал, что у примерно 14% здоровых людей гена R просто нет, а также, что совсем небольшая доля людей обходится без гена С. Зато вот число генов А и В очень значимо: у здоровых людей их всегда в сумме 4 (обычно 2 от мамы и 2 от папы, но встречаются и варианты 3 + 1), а вот уменьшение или увеличение числа копий А + В неминуемо ведет к микроцефалии или макроцефалии. Интересно, что более тяжелые отклонения в психике (в частности, аутизм) и интеллектуальном развитии связаны как раз с увеличением числа копий генов, в то время как снижение числа копий генов отражалось главным образом в форме нарушений настроения — повышенной тревожности и т. п.

Ну и все-таки, каков же механизм выявляемого действия белков семейства Notch2NL на процессы роста и дифференцировки клеток коры головного мозга? Чтобы ответить на этот вопрос, ученые сначала сформулировали гипотезы, и придумали тест-систему для их проверки. Гипотезы, а, следовательно, и тест-системы были разные. Так или иначе, обе группы исходили из того установленного факта, что белки Notch2NL присутствуют в гиалоплазме (полужидком содержимом) клеток, в эндоплазматической сети и аппарате Гольджи, а также секретируются в межклеточное пространство.

Начнем с группы из США. Они предположили, что белки Notch2NL действуют снаружи клеток, связываясь с рецепторами Notch и активируя их тем же путем, как это делают лиганды типа DLL (рис. 6, А), тем самым оказывая дополнительное стимулирование клеток в направлении пролиферации. Связывание белков Notch и Notch2NL подтвердили иммунопреципитацией: действительно, антителами к любому из этих белков вылавливались в том числе и комплексы из связанных белков. А для того, чтобы подтвердить весь механизм, делали вот что. Обычные эпителиальные клетки в культуре (в которых не экспрессируются ни рецепторы, ни лиганды Notch) модифицировали вектором, в котором был ген Notch. Но внутриклеточный домен NICD был заменен на домен другого транскрипционного фактора, который мог активировать экспрессию гена-репортера (его продукт можно увидеть по окрашиванию клеток), также вносимого в клетки искусственно. Как вы помните (рис. 3), чтобы этот домен мог сработать, рецептор должен быть активирован через внеклеточный домен. В том же векторе вносился ген Notch2NL (вариант А или В). В контрольном векторе гена Notch2NL не было. Результат оценивали по уровню экспрессии гена-репортера. Система сработала именно так, как и рассчитывали авторы: ген репортер экспрессировался на 20–60% выше в присутствии Notch2NL. Таким образом следует вывод, что эти белки, секретируясь, могут активировать клетки, несущие на себе рецептор Notch, через их внеклеточный домен.

Ученые из Бельгии рассмотрели альтернативную и не менее логичную гипотезу (рис. 6, В). Рассуждали так: белки Notch2NL очень похожи на внеклеточный домен рецептора Notch. Вполне вероятно, что они будут связываться с лигандами DLL. Проверили опять же иммунопреципитацией — да, связываются. Мы знаем, что лиганды могут связывать рецепторы Notch in cis(см. Цис-регуляторные элементы) и блокировать их работу, подталкивая тем самым клетку к дифференцировке (рис. 3). А что, если Notch2NL связывают лиганды прямо внутри клетки (еще до транспортировки рецептора к наружной мембране), препятствуя осуществлению ингибирования in cis? Опять же, ученые придумали схему для проверки. Они модифицировали клетки мозга ранних живых эмбрионов мышей (модификация электропорацией прямо в матке) векторами, которые содержали репортерный красный флуоресцирующий белок, ген DLL (в отличие от внутреннего гена DLL, экспрессия этого гена не может быть подавлена на уровне транскрипции за счет активности Notch), а также содержали или не содержали ген Notch2NL. В контрольном варианте вектор содержал только репортерный ген. Затем, спустя время, необходимое для дифференциации слоев коры, смотрели, как распределятся светящиеся клетки по зонам вдоль среза коры. Как и следовало из гипотезы авторов, при постоянной экспрессии DLL в клетках стимулировалась их дифференцировка и светящиеся клетки оказывались преимущественно в кортикальной пластинке, но если в этих же клетках синтезировался белок Notch2NL, распределение светящихся клеток становилось более близким к контролю. Следовательно, действие Notch2NL в этом эксперименте очевидно опосредовано взаимодействием этих белков с DLL.

Остается заключить, что и те, и другие авторы молодцы — выдвинули верные гипотезы, а природа молодец вдвойне — нашла возможность для обеспечения адаптивного результата сразу по двум механизмам, создав всего-то несколько дополнительных копий фрагмента уже имеющегося гена.

Любопытно, что статьи не только опубликованы рядом в одном номере одного журнала, но и поступили в редакцию с разницей в два дня. Если это было целенаправленное сотрудничество, то команды, на мой взгляд, можно только поприветствовать. Им удалось сообща получить очень интересный результат.

Источники:
1) Ian T. Fiddes et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.051.
2) Ikuo K. Suzuki et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Expand Cortical Neurogenesis through Delta/Notch Regulation // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.067.

См. также:
Ю. Кондратенко. Энхансеры и промоторы, регулирующие формирование коры головного мозга, у человека активнее, чем у других животных.

Об амплификации и неофункционализации генов см. также:
1) Многофункциональные гены — основа для эволюционных новшеств, «Элементы», 30.06.2008.
2) Конфликт между копиями удвоившегося гена ведет к избыточному усложнению генно-регуляторных сетей, «Элементы», 10.10.2013.
3) Дупликация гомеобоксных генов могла быть одной из причин кембрийского взрыва, «Элементы», 13.02.2015.
4) Найден ген, превращающий простые листья в сложные, «Элементы», 18.02.2014.
5) Процесс появления новых ферментов прослежен в эволюционном эксперименте, «Элементы», 23.10.2012.

Татьяна Романовская