Человеческий мозг такой большой благодаря генам семейства Notch2NL

Сразу два коллектива ученых опубликовали статьи с результатами своих исследований генетических механизмов работы мозга. Было обнаружено, что вся история начинается с дупликации гена Notch2, кодирующего важнейший мембранный белок-рецептор, играющий роль в передаче сигналов между соседними клетками и в регуляции процессов деления/дифференцировки нейронов в мозге эмбриона. Дупликация первоначально произошла у общего предка человека, гориллы и шимпанзе, но на этом этапе копия фрагмента гена Notch2 (обозначаемая Notch2NL) оказалась нефункциональной. Однако около трех миллионов лет назад в линии австралопитеков генная конверсия привела к восстановлению рамки считывания, а на протяжении последующей истории эволюции рода Homo произошло еще три дупликации новообразованного гена. Так образовалось семейство генов Notch2NL. Эти гены кодируют белки, очень похожие на Notch2, но секретируемые, а не встроенные в мембрану рецепторы. Работая в тканях растущего мозга, они повышают интенсивность клеточных делений клеток-предшественников нейронов и формирование более крупного мозга с более развитой корой. Выводы ученых подкрепляются давно установленной ролью мутаций типа делеций/дупликаций соответствующего участка хромосомы в развитии макроцефалии и микроцефалии у людей.

Недавно в журнале Cell одновременно были опубликованы два исследования, посвященные новооткрытым генам, сыгравшим, по-видимому, существенную роль в эволюции размера человеческого мозга. Статья большой группы ученых из преимущественно американских научных учреждений во главе с Иэном Фиддесом (Ian T. Fiddes) называется Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Статья их коллег из Брюссельского свободного университета во главе с Икуо Судзуки (Ikuo K. Suzuki) называется Human-Specific NOTCH2NL Genes Expand Cortical Neurogenesis through Delta/Notch Regulation. Но прежде, чем начать рассказ о новых открытиях, нужно разобраться в двух общебиологических феноменах, имеющих прямое отношение к делу.

Первый — формирование коры головного мозга в ходе эмбрионального развития. Головной мозг образуется как расширение на переднем конце нервной трубки, у человека его формирование начинается на 3–4 неделе развития эмбриона (основные этапы развития центральной нервной системы человека хорошо показаны в этом видео). И уже на самом раннем этапе начинает формироваться будущая кора головного мозга. Схема этого процесса показана на рис. 2. Наиболее недифференцированные нейрогенные клетки располагаются в самом глубоком слое — вентрикулярной зоне (ventricular zone). Отсюда клетки перемещаются в субвентрикулярную зону (subventricular zone), где происходит их активное размножение. По мере дальнейшего продвижения в промежуточную зону и, наконец, кортикальную пластинку клетки-предшественники дифференцируются в зрелые нейроны. В коре взрослого человека шесть слоев зрелых нейронов, со специальными свойствами и функциями, но на отображенных этапах эмбрионального развития присутствуют лишь некоторые из них — на рис. 2 эти слои подписаны цифрами.

Рис. 2. Кортикогенез — развитие коры головного мозга человека

Второй феномен — что собой представляет сигнальный каскад Notch-рецепторов, и каким образом он помогает определить судьбу клеток в развивающемся мозге эмбриона. Схема и пояснения на рис. 3. В этой системе есть два ключевых игрока: собственно, рецептор Notch и его лиганд (белок, специфично взаимодействующий с белком Notch). И рецептор, и лиганд представляют собой мембранные белки — это значит, что часть молекулы заякорена в мембране, часть торчит снаружи от клетки (внеклеточный домен), а еще одна часть, наоборот, обращена внутрь клетки (внутриклеточный домен). Смысл в том, что, приняв сигнал снаружи (взаимодействие с лигандом), рецептор изменяется таким образом, что сигнал передается на внутриклеточный домен, а далее каскад событий уже внутри клетки меняет ее поведение — в данном случае, направление дифференцировки (см. также видео).

Вся эта система содержит одну интересную и важную хитрость: первоначально на незрелых клетках экспрессируются в небольшом числе и рецепторы, и лиганды. Но после того, как контакт двух соседних клеток произошел, сложная система обратных связей приводит к тому, что та клетка, которая вступила в контакт молекулой-рецептором (случайно), начинает синтезировать больше молекул-рецепторов, но меньше молекул-лигандов. Та же клетка, которая вступила в контакт молекулой-лигандом (тоже случайно), — наоборот, синтезирует в дальнейшем меньше молекул-рецепторов, и больше молекул-лигандов. Так две соседние клетки, изначально одинаковые, становятся разными и принимают разные направления дифференцировки. В случае нейронов та клетка, которая преимущественно представляет рецептор, сохраняет потенциал дальнейшего деления, то есть свойства незрелой клетки, а та, которая преимущественно представляет лиганд, прекращает делиться и переходит к дифференцировке в зрелый нейрон. Нужно отметить, что система Notch-сигналинга (Notch signaling pathway) имеется у всех животных и многократно задействована в дифференцировке самых разных тканей, включая, помимо мозга, мышцы, слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, поджелудочную железу, кроветворение и пр.

Два обсуждаемых исследования замечательно дополняют друг друга. Во-первых, они подтверждают одинаковые выводы, но используют разные методические подходы, что очень повышает градус доверия к полученным результатам. Во-вторых, каждое из них выявляет какие-то стороны функционирования системы сигналинга, которые не были рассмотрены в другой работе.

Общие итоги (совпадающие в двух работах) следующие:
    1) Гены семейства Notch2NL сформировались посредством нескольких событий внутрихромосомных дупликаций. Вся цепочка событий занимает промежуток от 8–10 млн лет назад (когда жил общий предок гориллы, шимпанзе и человека) до около 0,5 млн лет назад, когда произошла последняя дупликация в линии, ведущей непосредственно к людям. Вся история показана на рис. 4. Тут сразу нужно отметить, что участок хромосомы 1q21 (именно здесь располагаются 3 из 4 членов семейства Notch2NL) давно известен как горячая точка делеций и дупликаций в популяции людей, причем эти мутации ассоциируются с патологиями развития и работы центральной нервной системы.

    2) Гены Notch2NL экспрессируются в эмбриональной коре головного мозга, там же, где и ген-предшественник рецептора Notch2. Четыре гена семейства (Notch2NLA, Notch2NLB, Notch2NLC, Notch2NLR) экспрессируются неодинаково активно, распределяясь таким образом: A > B > C > R (рис. 1).
    3) В экспериментах искусственное повышение экспрессии Notch2NL (типа А и В) в клетках приводило к увеличению числа делящихся клеток и снижению числа дифференцированных клеток. Искусственное отключение этих же генов давало противоположный результат. В частности, на рис. 5, взятом из обсуждаемой статьи «американской» группы, показаны результаты работы по манипуляции с искусственными органоидами мозга, выращенными из человеческих или мышиных эмбриональных стволовых клеток. Их коллеги из Бельгии получили аналогичный результат на колониях эмбриональных клеток в культуре, а также на полноценных мышиных эмбрионах, клетки мозга которых генетически модифицировали посредством электропорации прямо в матке мышки-мамы.

Теперь нужно сказать об индивидуальных заслугах авторов.

Анализ геномов нескольких сотен людей, который провела «американская» группа, показал, что у примерно 14% здоровых людей гена R просто нет, а также, что совсем небольшая доля людей обходится без гена С. Зато вот число генов А и В очень значимо: у здоровых людей их всегда в сумме 4 (обычно 2 от мамы и 2 от папы, но встречаются и варианты 3 + 1), а вот уменьшение или увеличение числа копий А + В неминуемо ведет к микроцефалии или макроцефалии. Интересно, что более тяжелые отклонения в психике (в частности, аутизм) и интеллектуальном развитии связаны как раз с увеличением числа копий генов, в то время как снижение числа копий генов отражалось главным образом в форме нарушений настроения — повышенной тревожности и т. п.

Ну и все-таки, каков же механизм выявляемого действия белков семейства Notch2NL на процессы роста и дифференцировки клеток коры головного мозга? Чтобы ответить на этот вопрос, ученые сначала сформулировали гипотезы, и придумали тест-систему для их проверки. Гипотезы, а, следовательно, и тест-системы были разные. Так или иначе, обе группы исходили из того установленного факта, что белки Notch2NL присутствуют в гиалоплазме (полужидком содержимом) клеток, в эндоплазматической сети и аппарате Гольджи, а также секретируются в межклеточное пространство.

Начнем с группы из США. Они предположили, что белки Notch2NL действуют снаружи клеток, связываясь с рецепторами Notch и активируя их тем же путем, как это делают лиганды типа DLL (рис. 6, А), тем самым оказывая дополнительное стимулирование клеток в направлении пролиферации. Связывание белков Notch и Notch2NL подтвердили иммунопреципитацией: действительно, антителами к любому из этих белков вылавливались в том числе и комплексы из связанных белков. А для того, чтобы подтвердить весь механизм, делали вот что. Обычные эпителиальные клетки в культуре (в которых не экспрессируются ни рецепторы, ни лиганды Notch) модифицировали вектором, в котором был ген Notch. Но внутриклеточный домен NICD был заменен на домен другого транскрипционного фактора, который мог активировать экспрессию гена-репортера (его продукт можно увидеть по окрашиванию клеток), также вносимого в клетки искусственно. Как вы помните (рис. 3), чтобы этот домен мог сработать, рецептор должен быть активирован через внеклеточный домен. В том же векторе вносился ген Notch2NL (вариант А или В). В контрольном векторе гена Notch2NL не было. Результат оценивали по уровню экспрессии гена-репортера. Система сработала именно так, как и рассчитывали авторы: ген репортер экспрессировался на 20–60% выше в присутствии Notch2NL. Таким образом следует вывод, что эти белки, секретируясь, могут активировать клетки, несущие на себе рецептор Notch, через их внеклеточный домен.

Рис. 6. Схемы регуляции дифференцировки нейронов коры при участии генов Notch2NL

Ученые из Бельгии рассмотрели альтернативную и не менее логичную гипотезу (рис. 6, В). Рассуждали так: белки Notch2NL очень похожи на внеклеточный домен рецептора Notch. Вполне вероятно, что они будут связываться с лигандами DLL. Проверили опять же иммунопреципитацией — да, связываются. Мы знаем, что лиганды могут связывать рецепторы Notch in cis(см. Цис-регуляторные элементы) и блокировать их работу, подталкивая тем самым клетку к дифференцировке (рис. 3). А что, если Notch2NL связывают лиганды прямо внутри клетки (еще до транспортировки рецептора к наружной мембране), препятствуя осуществлению ингибирования in cis? Опять же, ученые придумали схему для проверки. Они модифицировали клетки мозга ранних живых эмбрионов мышей (модификация электропорацией прямо в матке) векторами, которые содержали репортерный красный флуоресцирующий белок, ген DLL (в отличие от внутреннего гена DLL, экспрессия этого гена не может быть подавлена на уровне транскрипции за счет активности Notch), а также содержали или не содержали ген Notch2NL. В контрольном варианте вектор содержал только репортерный ген. Затем, спустя время, необходимое для дифференциации слоев коры, смотрели, как распределятся светящиеся клетки по зонам вдоль среза коры. Как и следовало из гипотезы авторов, при постоянной экспрессии DLL в клетках стимулировалась их дифференцировка и светящиеся клетки оказывались преимущественно в кортикальной пластинке, но если в этих же клетках синтезировался белок Notch2NL, распределение светящихся клеток становилось более близким к контролю. Следовательно, действие Notch2NL в этом эксперименте очевидно опосредовано взаимодействием этих белков с DLL.

Остается заключить, что и те, и другие авторы молодцы — выдвинули верные гипотезы, а природа молодец вдвойне — нашла возможность для обеспечения адаптивного результата сразу по двум механизмам, создав всего-то несколько дополнительных копий фрагмента уже имеющегося гена.

Любопытно, что статьи не только опубликованы рядом в одном номере одного журнала, но и поступили в редакцию с разницей в два дня. Если это было целенаправленное сотрудничество, то команды, на мой взгляд, можно только поприветствовать. Им удалось сообща получить очень интересный результат.

Источники:
1) Ian T. Fiddes et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.051.
2) Ikuo K. Suzuki et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Expand Cortical Neurogenesis through Delta/Notch Regulation // Cell. 2018. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.067.

См. также:
Ю. Кондратенко. Энхансеры и промоторы, регулирующие формирование коры головного мозга, у человека активнее, чем у других животных.

Об амплификации и неофункционализации генов см. также:
1) Многофункциональные гены — основа для эволюционных новшеств, «Элементы», 30.06.2008.
2) Конфликт между копиями удвоившегося гена ведет к избыточному усложнению генно-регуляторных сетей, «Элементы», 10.10.2013.
3) Дупликация гомеобоксных генов могла быть одной из причин кембрийского взрыва, «Элементы», 13.02.2015.
4) Найден ген, превращающий простые листья в сложные, «Элементы», 18.02.2014.
5) Процесс появления новых ферментов прослежен в эволюционном эксперименте, «Элементы», 23.10.2012.

Татьяна Романовская

Источник