Некодирующие РНК убивают раковые клетки, блокируя сразу несколько жизненно важных для них генов
Белок CD95 — одна из ключевых молекул, обеспечивающих выживание раковых клеток. Давно известно, что можно заблокировать производство этого белка с помощью некодирующих РНК. При этом запускается несколько путей гибели клеток опухоли одновременно. Группа исследователей из США и Великобритании обнаружила, что эти некодирующие РНК параллельно тормозят работу еще нескольких генов, необходимых для выживания раковой клетки, что приводит к ее гибели. Теперь становится ясно, что ген CD95 связан с другими ключевыми генами в раковой клетке. И, возможно, у нас появится новый способ борьбы с опухолевыми клетками.
Полезный белок CD95
Опухолевая трансформация клетки сопровождается не только изменением механизмов ее роста и деления, но и включением новых сигнальных каскадов. Один из них запускается при связывании белка CD95 (рецептора), расположенного на поверхности клетки, с белком CD95L (лигандом), находящимся на поверхности другой клетки. В здоровых клетках этот сигнальный каскад приводит к гибели клетки по механизму апоптоза и запуску каспаз — ферментов, расщепляющих клеточное содержимое. Его используют лимфоциты для избирательного уничтожения «сомнительных» клеток организма, то есть он работает как естественная противоопухолевая защита. Однако в раковых клетках активация CD95, наоборот, позволяет клеткам выжить. Более того, в опухоли практически не удается обнаружить раковые клетки без этого белка.
Впрочем, справедливости ради следует отметить, что связывание CD95 и CD95L положительно влияет на клетки и в некоторых других ситуациях — например, при поддержании жизнеспособности стволовых клеток, нейрогенезе и регенерации печени. Из этого можно заключить, что наши знания об этом многофункциональном сигнальном каскаде далеко не полны (см. P. Ceppi et al., 2014. CD95 and CD95L promote and protect cancer stem cells).
Но вернемся к раковым клеткам. Еще несколько лет назад было обнаружено, что достаточно лишить раковую клетку белка CD95 или его лиганда CD95L, чтобы она погибла. При этом одновременно запускается несколько механизмов гибели (рис. 1) и наблюдаются черты как некроза (набухание клетки и накопление активных форм кислорода — агрессивных кислородсодержащих молекул), так и апоптоза (повреждение ДНК, активация ферментов каспаз и повреждение митохондрий). Такую форму гибели назвали DICE (death induced by CD95 elimination; смерть, вызванная удалением CD95) (см. A. Hadji et al., 2014. Death Induced by CD95 or CD95 Ligand Elimination). Этот механизм проверили на разных известных типах рака, и оказалось, что везде он работает.
Как заблокировать работу CD95?
В экспериментах для блокирования работы CD95 и CD95L обычно используют метод РНК-интерференции. Это естественный механизм, с помощью которого клетка регулирует экспрессию генов (рис. 2). Вкратце он выглядит следующим образом: в ядре транскрибируется микроРНК (один из видов некодирующих РНК), белок Drosha отрезает от нее всё лишнее, она сворачивается в шпильку (мшРНК, малая РНК в форме шпильки) и выходит в цитоплазму. Там молекулярный комплекс Dicer отрезает шпильку. Получившийся участок двуцепочечной ДНК разделяется на одиночные цепи, которые ловит молекулярный комплекс RISC.
Каждая из таких одиночных цепей РНК называется малой интерферирующей РНК (миРНК). Комплекс RISC с миРНК внутри может уловить информационную РНК (иРНК) и связаться с ней, если последовательность миРНК комплементарна какому-либо участку иРНК. После того как связывание произошло, RISC расщепляет обе молекулы РНК. То есть иРНК не достигает рибосомы, с нее не считывается информация и не образуется кодируемый ей белок. В случае, когда последовательность миРНК не полностью комплементарна иРНК, связывание недостаточно крепко для расщепления, но при этом трансляция всё равно невозможна, поскольку рибосома «спотыкается» о молекулярные комплексы на иРНК.
РНК-интерференцию часто используют исследователи, чтобы лишить клетку какого-либо белка. Так, например, в предыдущих экспериментах использовали миРНК или мшРНК для блокады трансляции иРНК CD95 и CD95L. Однако при этом возникает проблема нецелевых (побочных) эффектов (off-target effects). Если миРНК случайно связывается, помимо своей мишени, с иРНК другого гена, то трансляция этой иРНК тоже блокируется. Авторы обсуждаемой статьи предположили, что именно нецелевые эффекты ответственны за гибель раковых клеток, у которых блокируют CD95 и CD95L. Они предлагают модель, согласно которой миРНК останавливают производство сразу нескольких белков, в том числе и необходимых для выживания клетки. Для проверки этой гипотезы исследователям пришлось тщательно проверить каждый этап РНК-интерференции. В результате дизайн их экспериментов представляет собой образец подробной и постепенной реконструкции событий.
Экспериментальные вопросы и ответы
1. Правда ли, что так работают именно мшРНК против белков CD95 и CD95L?
Авторы воспользовались банком данных по мшРНК, собранным в предыдущих исследованиях. Он представляет собой перечень всех мшРНК, обнаруженных в клетках опухоли. Оказалось, что в большинстве раковых клеток отсутствуют мшРНК именно против белков CD95 и CD95L, из чего следует, что наличие этой мшРНК клеткам почему-то невыгодно. Затем авторы подействовали на клетки опухоли именно этими мшРНК, которые в норме отсутствуют, и это воздействие оказалось токсичным даже в небольших дозах.
2. Правда ли, что дело не только в блокаде белков CD95 и CD95L?
Самый простой способ это проверить — подействовать на клетки одновременно мшРНК к этим белкам и самими этими белками. Если дело только в них, то мшРНК заблокирует их синтез, но сами белки будут поступать извне, поэтому клетки должны выжить. Этот эксперимент получился неоднозначным: некоторые культуры погибали, несмотря на добавление белков CD95 и CD95L. Но другие не погибали, и авторы связывают это с активирующим действием этих белков.
Следующий шаг — посмотреть, что будет, если добавить мшРНК в клетку, но лишить их возможности блокировать трансляцию именно этих белков. Для этого исследователи ввели в клетки иРНК белков CD95 и CD95L, но предварительно внесли в их последовательность несколько замен. Эти замены не влияют на их функциональность, но затрагивают участки комплементарности разных мшРНК. То есть мшРНК не могли заблокировать деятельность своей основной мишени. Но даже это не помогло клеткам противостоять действию миРНК — следовательно, дело в каких-то побочных или нецелевых эффектах.
Наконец, авторы попробовали удалить из самого гена белков CD95 и CD95L участки связывания с мшРНК. Теперь мшРНК точно не должны были блокировать эти белки. Но и тогда клеткам не удалось избежать гибели. Для окончательного подтверждения эксперименты повторили на другой культуре опухолевых клеток, и там результаты получились похожими. Таким образом, можно заключить, что мшРНК к CD95 и CD95L вызывают гибель клеток, действуя на какие-то другие иРНК.
3. Вовлечен ли в процесс механизм РНК-интерференции?
Из предыдущих экспериментов известно, что мшРНК токсичны в больших концентрациях, потому что либо вызывают воспалительный ответ (как инородные нуклеиновые кислоты в клетке), либо конкурируют с собственными миРНК клетки, останавливая тем самым ее естественные процессы РНК-интерференции. Но мшРНК к CD95 и CD95L убивают клетки даже в небольших концентрациях, что говорит об их специфическом действии. Однако их участие в РНК-интерференции предстоит обосновать.
Во-первых, существует ряд технический требований к миРНК, чтобы они могли связаться с комплексом RISC. Они должны состоять из нуклеотидов РНК (а не ДНК), быть изначально двунитевыми, нести неспаренные нуклеотиды на 3’-конце и определенную последовательность на 5’-конце. Изменение любого из этих свойств привело бы к потере токсичности миРНК для клеток, что предполагает их связывание с RISC.
Во-вторых, можно проверить, без каких участников процесса мшРНК не работает. Клетки, лишенные белка Drosha (который отрезает от мшРНК лишнее после транскрипции), также погибают при добавлении мшРНК к CD95 и CD95L. А вот клетки без белка Dicer оказываются устойчивыми. Dicer участвует в расщеплении мшРНК и образовании миРНК. То есть получается, что РНК-интерференция необходима для токсичного действия мшРНК.
4. Правда ли, что происходит подавление генов выживания?
Авторы статьи подействовали мшРНК к CD95 и CD95L на клетки, лишенные их мишеней (то есть ключевые последовательности в иРНК CD95 и CD95L были изменены). Затем проследили за профилем экспрессии других генов в этих клетках. Оказалось, что под действием мшРНК существенно растет экспрессия одного гена и падает экспрессия одиннадцати генов. Интересно, что девять из этих одиннадцати, как показал обзор литературы, особенно активны в раковых клетках, а их выключение приводит к гибели клетки. А шесть из одиннадцати, по данным двух независимых скринингов, необходимы для выживания опухоли и часто мутируют при злокачественной трансформации. Подавление работы этих генов авторы наблюдали уже через 14 часов после введения мшРНК в клетки, за два дня до начала гибели клеток. Это позволяет предположить, что именно блокада работы этих генов оказывается критична для клеток.
Чтобы подтвердить значимость этих одиннадцати генов, авторы провели похожий эксперимент на другой клеточной культуре. Они избирательно блокировали работу именно этих одиннадцати генов с помощью специализированных миРНК, что позволило остановить рост опухолевой культуры и вызывать смерть некоторого количества клеток. После этого стало возможно говорить о том, что работа этих генов универсальна в разных типах опухолей.
Наконец, авторы отследили долгосрочное влияние миРНК на экспрессию генов — через 48 и 100 часов после ее внедрения в клетки. Оказалось, что гены, известные по предыдущим работам как необходимые для выживания, перестают работать, в то время как экспрессия других генов, не влияющих напрямую на жизнеспособность клетки, сохраняется. В списке «подавленных» обнаружились гены гистонов (по непонятным пока причинам), а также гены, отвечающие за деление клетки и скручивание ДНК (рис. 3). Похожая картина наблюдается при при митотической катастрофе (см. Mitotic catastrophe) — клеточной смерти, которая сочетает в себе разные пути гибели и наступает, если клетке не удается поровну разделить генетический материал при делении.
5. Как именно миРНК подавляют гены выживания?
Получив список генов, чью работу блокирует мшРНК к CD95 и CD95L, авторы работы проанализировали их последовательности. Оказалось, что в иРНК, синтезированной с этих генов, есть последовательности, комплементарные миРНК к CD95 и CD95L. И все они расположены на 5’-конце иРНК в нетранслируемой области. Этот участок не несет информации о строении белка, а нужен только для узнавания рибосомой. В значимых, информативных областях иРНК не обнаружили последовательностей, комплементарных миРНК к CD95 и CD95L. Самой «притягательной» для токсичных миРНК оказалась последовательность всего из шести нуклеотидов. И именно ее в больших количествах обнаружили в одиннадцати генах, которые блокируются самыми первыми.
6. Какие мшРНК самые токсичные?
Авторы статьи синтезировали все возможные миРНК, комплементарные иРНК CD95 и CD95L, и сравнили их действие на клетки. Оказалось, что самые токсичные миРНК связываются с нетранслируемой областью CD95 и информативной частью CD95L. Сравнение последовательностей этих миРНК показало, что токсичность связана с количеством Г-Ц-пар в их составе.
Вооружившись этими данными, авторы проанализировали состав самых разных генов в геноме человека. Оказалось, что области, богатые Г-Ц-парами и «притягательными» последовательностями, чаще встречаются в генах, критичных для выживания, чем в каких-либо других. Судя по всему, именно поэтому миРНК к CD95 и CD95L подавляют их работу.
Итоги
Резюмируем итоги исследования. Авторам удалось показать, что миРНК к CD95 и CD95L убивают раковые клетки вне зависимости от работы белков CD95 и CD95L. Эти миРНК связываются с иРНК других генов, несущих определенные последовательности, и разрушают их с помощью РНК-интерференции. В генах, критичных для выживания, эти последовательности встречаются гораздо чаще, чем в других. Поэтому происходит блокада работы генов выживания, и раковая клетка погибает посредством механизма, сочетающего черты разных типов клеточной смерти.
Эта работа имеет несколько важных следствий. С одной стороны, РНК-интерференция может оказаться важным методом борьбы с опухолями. Поскольку миРНК к CD95 и CD95L активируют одновременно несколько путей гибели клетки, то маловероятно, что клетка опухоли окажется устойчивой ко всем. Даже если в ней тем или иным способом заблокирован апоптоз, то сработает некроз, и наоборот. Кроме того, авторы отсылаются к своим предыдущим работам, в которых они показали, что миРНК более эффективны против раковых клеток, чем против здоровых. Они объясняют это тем, что в раковых клетках снижено общее количество миРНК (как они тоже обнаружили ранее). Возможно, при этом у токсичных миРНК меньше конкурентов, и их действие оказывается более эффективным. Авторы также ссылаются на свое параллельное исследование, в котором они обработали наночастицами, содержащими миРНК к CD95 и CD95L, опухоль в яичнике мыши. При этом им удалось вызвать некроз опухоли, не навредив остальным органам животного (рис. 4).
С другой стороны, вызывает интерес сам факт наличия подобных токсичных РНК в клетке. Если миРНК, провоцирующая гибель клетки, комплементарна к последовательностям CD95 и CD95L, то это значит, что из иРНК, кодирующих эти белки, можно теоретически такие миРНК получить. И тогда начинает вырисовываться новый механизм, которым клетка теоретически могла бы сопротивляться раковой трансформации. Клетка становится опухолевой → растет экспрессия CD95 и CD95L → в клетке накапливается их иРНК → часть ее разрезают на кусочки → получаются миРНК → они блокируют гены выживания → клетка умирает. Однако до сих пор неизвестно, работает ли этот механизм в действительности. И возникает логичное предположение, что это не единственные последовательности, обладающие такими свойствами. Возможно, это только первый шаг на пути понимания нового механизма регуляции клеточной судьбы.
Источник: William Putzbach, Quan Q. Gao, Monal Patel, Stijn van Dongen, Ashley Haluck-Kangas, Aishe A. Sarshad, Elizabeth T. Bartom, Kwang-Youn A. Kim, Denise M. Scholtens, Markus Hafner, Jonathan C. Zhao, Andrea E. Murmann, Marcus E. Peter. Many si/shRNAs can kill cancer cells by targeting multiple survival genes through an off-target mechanism // eLife. 2017. V. 6. P. e29702. DOI: 10.7554/eLife.29702.
Полина Лосева