Компьютер может классифицировать опухоли мозга на основании профилей метилирования ДНК
Ни в одном другом органе нет такого разнообразия клеток, как в мозге. С этим связано и большое разнообразие доброкачественных и злокачественных опухолей мозга. Сейчас их в основном диагностируют при помощи гистологических анализов, проводимых врачами, которые могут ошибаться и заблуждаться. Немецкие ученые предлагают объективный подход к дифференциальной диагностике, основанный на распределении метильных остатков в ДНК, которое может быть оценено с помощью компьютера. Тестовые испытания показали более высокую точность этого подхода, а в ряде случаев они дали основания пересмотреть результаты гистологического анализа. Но широкое применение этого подхода пока затруднено, в перспективе наиболее целесообразной представляется диагностика с помощью комбинации нового подхода с классической гистологией.
Клетки нервной системы, особенно головного мозга, отличаются высоким разнообразием, которое отражается и в разнообразии опухолей мозга — их известно уже примерно 100 типов. Спектр неоплазий тканей мозга очень широк: от доброкачественных опухолей, которые достаточно удалить хирургическим путем (например, пилоцитарная астроцитома), до чрезвычайно агрессивных злокачественных, которые слабо реагируют на терапевтические средства (например, глиобластома). Поэтому правильный диагноз очень важен для определения стратегии лечения. Основной подход к диагностике опухолей мозга — гистологический анализ (по морфологическим признакам) образцов ткани опухоли, полученных при биопсии. Проблема в том, что у разных специалистов-гистологов при исследовании одной и той же опухоли могут получаться сильно разные результаты. Так что новые подходы и стандартизация дифференциальной диагностики опухолей центральной нервной системы (ЦНС) могут помочь сильно продвинуться в борьбе с этими, как правило, очень тяжелыми заболеваниями.
В последние годы было показано, что многие опухоли центральной нервной системы имеют не только специфические особенности в морфологии клеток, но и специфические изменения молекулярных маркеров. В 2016 году Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала использовать для диагностики опухолей ЦНС и гистологические исследования, и данные о молекулярных аномалиях (D. N. Louis et al., 2016. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary).
Метилирование (присоединение метильных групп к определенным остаткам цитозина) — эпигенетическая модификация структуры ДНК, происходящая после ее синтеза. Метилирование не изменяет последовательность нуклеотидов, но способно влиять на экспрессию многих генов (транскрипцию мРНК) и, в конечном счете, — на судьбу клетки. Уже достаточно убедительно показано, что аномальное метилирование может быть связано с формированием и развитием раковых опухолей: в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками той же ткани существенно изменяется распределение метильных остатков по ДНК. Больше того, спектр метилирования разных участков ДНК, с одной стороны, специфичен для клеток, от которых происходит опухоль, а с другой стороны, его изменения специфичны для каждого типа опухоли. При этом спектр метилирования стабилен и воспроизводим даже для маленьких образцов опухоли и для материала плохого качества.
Большая группа ученых и врачей, ведущая роль среди которых принадлежит сотрудникам Немецкого центра исследования рака, исследовала возможность широкого применения компьютерного анализа распределения метилированных участков ДНК в качестве альтернативы визуальной гистологической классификации опухолей мозга.
Современные технологии, в частности высокоэффективное секвенирование ДНК, гибридизация фрагментов ДНК на чипах с определенными последовательностями нуклеотидов, позволяют определить распределение метилированных цитозинов по всему геному. Обработка ДНК бисульфитом натрия (NaHSO3) превращает цитозин в урацил, который в ходе дальнейшей полимеразной цепной реакции (ПЦР) замещается тимином. Метилированный цитозин при этом не затрагивается, и в ПЦР замещается цитозином. Эти различия (тимин/цитозин) затем можно уловить известными методами. Достоинства такого способа — универсальность (все делается автоматически) и неприхотливость к качеству исходного материала: пригодную для исследования ДНК можно экстрагировать, например, из длительно хранившихся гистологических препаратов, зафиксированных формалином и импрегнированных парафином.
Так ученые получили профили метилирования клеток из 2801 опухоли, относящихся практически ко всем известным типам опухолей центральной нервной системы по классификации ВОЗ. Эти данные были обработаны специально разработанными алгоритмами с использованием методов машинного обучения: такая компьютерная классификация и была целью работы — ученые хотели получить надежный и не зависящий от человеческих оценок (присущих традиционным гистологическим исследованиям) способ диагностирования типов опухолей ЦНС. В результате тестовая выборка разбилась на 82 кластера, из которых только 29 соответствовали типам опухолей из классификации ВОЗ (рис. 1). Еще 29, распознаваемых ВОЗ как подклассы, компьютер выделил в самостоятельные классы, 19 кластеров не полностью соответствовали классификации ВОЗ (у 8 из них не совпадали градации (см. WHO grading of CNS tumours), а у 11 границы областей метилирования несколько не совпадали с указанными в «официальной» классификации), а еще 5 абсолютно не соответствовали этой классификации.
Примечательно, что часть опухолей, отнесенных ВОЗ к разным типам, по результатам этого оказались сходными по профилю метилирования, и, наоборот, у некоторых опухолей, которые ВОЗ относила к одному типу, оказались разные профили. Возможно, выявленные сходства и различия опухолей на молекулярном уровне, не зависящие от гистологических характеристик, повлекут необходимость изменения принятой классификации и дадут дополнительные возможности для совершенствования подходов к диагностике и лечению.
Далее авторы провели контрольные тесты по сравнению компьютерной классификации и данных гистологического анализа на 1014 пробах (рис. 2). В 60,4% случаев результаты совпали, еще в 15,5% случаев компьютер смог уточнить результат человека (указав подкласс, к которому относится опухоль). В 12,6% случаев заключения компьютера и данные гистологов оказались абсолютно разными. Важно, что дополнительный детальный анализ с помощью, в частности, секвенирования, в 92,8% этих случаев показал правоту компьютера. 11,5% проб компьютер не смог классифицировать. Вероятно, по крайней мере часть этих проб взяты из редко встречающихся опухолей, для которых еще недостаточно данных.
Авторы полагают, что полученные ими результаты открывают перспективу для компьютерной классификации не только опухолей ЦНС, но и других раков, которая может фундаментально изменить представления о патологии опухолей. Детальный молекулярный профиль опухолей представляется очень ценным для определения диагноза и стратегии лечения. Убедительно показано, что подход, разработанный авторами, дополняет, совершенствует, а иногда и заставляет пересмотреть диагноз, поставленный по результатам микроскопии клеток опухоли. Но это не отменяет необходимости гистологического анализа. Во-первых, комбинация этих подходов скорее всего будет эффективнее, чем каждый из них по отдельности, поскольку болезнь может проявляться как на молекулярном, так и на клеточном уровне. Во-вторых, анализ метилирования и другие молекулярные подходы пока недоступны большинству клинических лабораторий из-за сложности, дороговизны и высоких требований к персоналу. Но методы и техники молекулярного анализа быстро дешевеют и упрощаются, так что их применение будет расширяться.
Источники:
1) D. Capper et al. DNA methylation-based classification of central nervous system tumours // Nature. 2018. DOI: 10.1038/nature26000.
2) D. Wong, S. Yip. Machine learning classifies cancer // Nature. 2018. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье.)
Вячеслав Калинин